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用mRNA差异显示法寻找人绒毛膜上皮癌与孕早期绒毛组织间的差异基因
来源: 点击数: 更新时间:2012-10-24 文章录入:liuxing
    

史桂芝 高英茂 顾晓松 刘梅 王宝恒

  【摘要】 目的 寻找人绒毛膜上皮癌(JAR)与孕早期绒毛组织间的差异基因。 方法 采用mRNA差异显示法(mRNA differential display PCR, DD-PCR),即分别提取正常孕早期绒毛及绒毛膜上皮癌的总RNA,在oligodT15作用下分别合成相应的cDNA,并以其为模板利用试剂盒中的20对引物组合和α-32PdATP,Taq酶等进行PCR,将两者的PCR产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳,放射自显影后寻找两者间的差异片段,回收差异片段进行二次PCR,对二次PCR产物先采用反杂交法初步筛选后再用Northern Blot鉴定。 结果 从PAG上切下32条差异条带,经反杂交初步筛选出11个阳性片段,对11个阳性片段分别做Northern Blot鉴定,其中1个片段(T26)的基因长度约1.2kb,其在绒毛膜上皮癌中的表达远高于正常绒毛组织。 结论 T26基因片段可能是绒癌相关基因。
  【关键词】 mRNA差异显示法(DD-PCR);绒毛膜上皮癌(JAR);绒毛;人
  【中图分类号】 R737.33 【文献标识码】 A 【文章编号】 0529-1356(2000)04-

mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY POLYMERASE CHAIN
REACTION WAS USED TO IDENTIFY DIFFERENTIAL
GENES BETWEEN CHORIOCARCINOMA AND THE FIRST
TRIMESTER VILLI TISSUE IN HUMAN

SHI Gui-zhi GAO Ying-mao
(Department of Histology and Embryology of Shandong Medical University, Jinan 250012)
GU Xiao-song LIU Mei
(Department of Neuroscience Institute of Nantong Medical University,Nantong 226001,China)
WANG Bao-heng
(Department of Technology of High People's Court of Shandong Province, Jinan 250014, China)

【Abstract】 Objective To identify differential genes between choriocarcinoma and the first trimester villi tissue in human. Methods mRNA differential display PCR(DD-PCR) was used. First both total RNAs were isolated and reversely transcribed into cDNAs respectively with oligodT15, then these cDNAs were gone through PCR by using primer pairs from DeltaTM Differential Display kit, α-32PdATP and Taq DNA Polymerase. The products of PCR were run on 6% denaturing polyacrylamide gels(PAG) and autoradiograms were examined to find the differential bands between both gels. The differential bands were reamplified using the same PCR condition as before. Reverse dot blot procedures and Northern analysis were used to identify the bands. Results From PAG 32 differential bands of choriocarcinoma were cut, from which 11 bands were identified through reverse dot blot procedure. Northern analysis showed that one band(T26) was much stronger in choriocarcinoma than in normal villi, its mRNA size is about 1.2kb. Conclusion Differential band T26 may have relevance with choriocarcinoma.
【Key words】 DD-PCR; Choriocarcinoma(JAR);Villi;Human

  胚胎孕早期绒毛滋养层细胞的发育与肿瘤细胞的增殖、分化及侵蚀性等方面有许多相似之处[1]。由于各种因素的影响,滋养层细胞过度增殖可恶化发展为绒毛膜上皮癌。目前对其发生机理尚不清楚。为了从分子水平上研究其致病机理,本研究采用近年发展起来的差异显示PCR技术[2],比较了胚胎孕早期绒毛滋养层细胞与绒毛膜上皮癌(JAR)之间的基因表达差异,尤其是寻找肿瘤相关基因,进而对肿瘤的发生机理研究提供帮助。

材料和方法

1.标本来源
  正常孕早期胎盘绒毛组织(孕50d至60d,自停经算起)取自南通医学院附属医院人流室;绒毛膜上皮癌细胞株(JAR cell line)购自上海细胞生物研究所。
2.提取总RNA及电泳鉴定
 2.1 提取总RNA:按TrizolTM Reagent (GIBCO)说明进行。取100mg左右正常流产绒毛组织及培养的绒癌细胞,分别加入Trizol反应液1.5ml匀浆,室温静置5min,加入0.3ml氯仿,充分震荡15s,室温静置2min,12 000×g 4℃ 离心15min。取上清,加入等体积的异丙醇,室温静置10min,12 000×g 4℃离心10min,弃上清,加入1.5ml 75%乙醇混旋沉淀,7 500×g 4℃离心5min,弃上清,晾干后,加入适量DEPC水溶解(65℃促溶15min)。测A 260/A 280,当比值大于1.7时进行下一步实验,以保证RNA的高纯度;根据A 260值计算RNA含量,RNA含量(g/L)=A 260×RNA稀释倍数×40 mg/L÷1 000。
 2.2 RNA电泳:用1×甲醛凝胶电泳缓冲液(20mmol/L MOPS, 8mmol/L 乙酸钠,1mmol/L EDTA)配制1%琼脂糖凝胶。调整两者RNA的浓度相同,取RNA溶液4.5μl(约30μg);依次加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl;甲醛3.5μl;去离子甲酰胺10μl,65℃变性15min,冰浴5min。加溴化乙锭(EB,1g/L)1μl,凝胶上样缓冲液2μl,混合后加入凝胶样品孔中。调整电场强度5V/cm,电泳2~3h。使用SH-100图像分析系统(上海四星生物公司)摄片记录结果后转尼龙膜。
 2.3 转膜:按毛细管转移法将凝胶中的RNA转移至与凝胶大小一致的尼龙膜上,80℃真空干烤2h,4℃真空保存。
3.逆转录
  正常绒毛及绒癌标本分别做一相应副管。调整上述RNA含量至1g/L,取2μl为模板,加入Oligo(dT)15引物(10μmol/L,上海植物生理研究所合成)1μl;焦碳酸二乙酯(DEPC)水3.5μl,混匀70℃ 10min,冰浴,依次加入下述试剂:10×反应缓冲液1μl;MgCl2(25 mmol/L)1μl; dNTP混合物(10 mmol/L)0.5μl;0.1mol/L二硫苏糖醇(DTT)1μl;Superscript RT Ⅱ(2×108U/L,GIBCO)0.5μl,混匀后离心,42℃ 50min,70℃ 15min,-20℃储存。
4.PCR
  在每一反应管中加入如下物质:10×反应缓冲液2μl;dNTP(2mmol/L)0.5μl;DeltaTM Differential Display Kit(CLONETECH)中锚定引物T1~T9之一(20μmol/L,例如引物T8序列:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3',引物T1~T9除3’端2个碱基不同外,余相同)1μl,随机引物P1~P10之一(20μmol/L,例如引物P10序列:5’-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3',引物P1~P10除3’端9个碱基不同外余相同)1μl,1∶10稀释的逆转录产物1.5μl;灭菌双蒸水13μl;Taq酶(2×106U/L,Bio star international, Canada)0.5μl;α-32PdATP(3000Ci/mmol,北京市亚辉生物医学工程公司)0.5μl。循环参数如下:第1个循环:94℃ 5min,40℃ 5min,68℃ 5min;第2~3个循环:94℃ 30s,40℃ 30s,68℃ 5min;第4~36个循环:94℃ 20s,60℃ 30s;68℃ 2min;最后68℃延伸7min。反应结束后即刻电泳。
5. 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及放射自显影
 5.1 配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶:用1×TBE电泳缓冲液(89mmol/L Tris碱;89mmol/L硼酸;2mmol/L EDTA)配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:N,N-亚甲双丙烯酰胺=19∶1;7 mmol/L尿素),用前取50ml加临时配制的25%过硫酸铵(AP)50μl,N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)50μl。混匀后灌入安置好的测序板内(Bio-Rad Ltd.)室温凝聚3h。
 5.2 电泳:将测序板装入电泳仪中,灌入1×TBE缓冲液,设置恒定温度为50℃,100W功率预电泳30min;停止预电泳,取前述PCR产物加等体积聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液[98%去离子甲酰胺;20mmol/L EDTA(pH 8.0);0.05%二甲苯青;0.05%溴酚蓝],94℃ 2min,上样。按预电泳条件电泳3h至二甲苯青达电泳槽底。
 5.3 放射自显影:将凝胶干燥,-70℃曝光适当时间,显影,定影。寻找正常绒毛组织与绒癌细胞之间的差异条带。
6.差异片段的回收及二次PCR
 6.1 回收差异片段:从凝胶上精确切下差异条带,加50μl灭菌双蒸水,100℃煮沸15min,将上清转至新的离心管中,-20℃储存。
 6.2 二次PCR:在0.5ml PCR管中建立扩增体系,除模板(回收的DNA)为3μl,不加同位素外,余条件同第1次PCR。
7.点杂交法(反杂交)初步筛选阳性差异条带
 7.1 点膜:取二次PCR产物及阳性对照(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH),分别加等体积A液(0.8mmol/L NaOH,20mmol/L EDTA),100℃ 10min,0℃冰浴,依次序将GAPDH及所有2次PCR产物分别点尼龙膜;加样后每孔用0.4mmol/L NaOH 500μl漂洗,2×SSC稍加漂洗后晾干,室温保存。
 7.2 探针标记:依照Prime-a-Gene○ R Labeling System(Promega)试剂盒中说明进行。取绒癌逆转录后的第1链4μl(约20ng),94℃ 3min,0℃冰浴中加入下列物质:dGTP,dTTP,dATP混合物2μl、10g/L BSA 1.0μl,5×标记缓冲液(Kit提供,内含随机寡脱氧核苷酸)5.0μl、α-32PdCTP(3 000Ci/mmol)3μl,ddH2O 9.5μl,Klenow酶(2×106IU/L)0.5μl。混匀后置25℃水浴1h。95℃ 3min终止反应,0℃冰浴。
 7.3 杂交:在杂交瓶中加入5ml预杂交液(1×Denhardt, 0.2% SDS,0.1g/L鲑鱼精子DNA,6×SSC),将尼龙膜放入,42℃预杂交3h,加入标记探针,42℃杂交过夜,次日洗膜(2×SSC,0.1%SDS室温15min,0.2×SSC,0.1%SDS 55℃ 15min)并进行放射自显影。
8.Northern blot鉴定阳性差异条带的大小
  方法基本同上述点杂交,将转了RNA的尼龙膜置于杂交瓶中,对点杂交筛出的阳性差异条带的二次PCR产物标记探针进行杂交。

结果

1.RNA电泳结果
  TRIZOL法提取的正常绒毛组织与绒癌的总RNA经甲醛变性胶电泳,皆可见清晰的18S,28S两条带,两者相应条带的亮度基本一致,说明两者总RNA的上样量基本一样,可作为下面Northern blot结果的内参,亦说明提取的总RNA完整性良好;左侧标尺显示了18S,28S两条带距加样孔的距离,可作为下面Northern blot结果的分子量参照.(图1,N、T分别表示正常绒毛及绒癌,下同)
2. mRNA差异显示结果
  以试剂盒中20对随机引物组合(例如T1,P1;T2,P1等)PCR扩增后进行PAGE放射自显影,共寻找出32条绒癌差异条带,即在绒癌中显示,在正常绒毛中不显示。如图2显示其中的一条差异条带结果。
3.点杂交结果
  将绒癌总RNA逆转录后的cNDA标记探针,与点于尼龙膜上的32条绒癌差异条带的二次PCR产物进行杂交,结果显示11个呈阳性(图3,A~K),左上方为阳性对照GAPDH。
4.Northern blot结果
  将上述点杂交中呈阳性结果的片段(二次PCR产物)分别标记探针进行Northern blot杂交,其中B~K的杂交信号不清晰,条带弥散,只有A的杂交信号显著,即图4中T26差异条带;根据图1中测量的RNA电泳时18S、28S到加样孔的距离,以18S(2 366bp),28S(6 333bp)片段大小的对数值对两者的迁移距离作图,用所得曲线计算从凝胶转移到尼龙膜后通过杂交所检出的RNA分子的大小[3];据此推测该阳性条带约1.2kb,其在绒癌中的表达远高于正常绒毛;在前方有一约4.4kb的条带,可能是由于mRNA前体的剪接不同所致。

 

图1 RNA的甲醛变性胶电泳结果,可见清晰的18S、28S两条带及其距加样孔的距离。
Fig.1 Electrophoresis of RNA on gel containing formaldehyde, showing 18S,28S two bands.

 

图2 显示引物T8、P10 PCR扩增后进行PAGE电泳及放射自显影结果;1,2泳道中的显示条带大部分相同;箭头所示条带T26只在绒癌中显示,在正常绒毛中不显示;3,4泳道是1,2泳道的相应副管结果,该图中3泳道条带显影较1泳道深是由于上样量稍多所致。
Fig.2 Autoradiograms of amplified α-32PdATP labeled PCR product using primer pairs of T8,P10(after electrophoresis in 6% polyacrylam-
ide gels)are shown above, T26(arrow) only appears in T instead of N;lane 3,4 are the correspond auxiliary results of lane 1,2.

 

图3 点杂交结果。
Fig.3 The results of dot blot.

 

图4 差异片段T26的northern blot结果。
Fig.4 Northern blot analysis of differential band T26.

讨论

  本实验采用的差异显示PCR方法是1992年哈佛大学的Peng Liang和Arthurb Pardee首先发明的,其较经典的差示杂交和消减杂交更为简便、快捷,更有可能得到阳性结果,而且可进行2种以上样本的多重比较。以我们的工作看,DD-PCR的确是分离差异基因的有效方法,但其不足是假阳性条带过多,为了减少假阳性片段的产生,我们在许多方面加以改进:
1.在cDNA合成时,我们使用oligodT15引物一次性将所有的mRNA全部逆转录为cDNA,减少了通常采用12种oligodT12MN锚定引物逆转录的繁琐,并且合成的cDNA质量并不受影响[4,5]。
2.利用Clontech公司优化的DeltaTM Differential Display Kit中引物进行PCR进行扩增,其包括10种随机引物(P1~P10;25bp)和9种oligodT锚定引物(T1~T9;29pb),其有许多优点:采用试剂盒中较长的引物进行PCR扩增,先启动3个低严谨度循环,后采用33个高严谨度循环以提高反应的特异性同时降低非特异性扩增,从而减少了假阳性条带的产生。我们随机选取了DD-PCR kit中的部分引物组合进行差示PCR,从PAG凝胶中共分离了32个有良好重复性的差异条带。
3.从聚丙烯酰胺凝胶上切取的差异条带由于多种原因的影响,并非所有的差异条带都是特异性基因表达产物,其中相当一部分是假阳性,因此需要对它们进行鉴定,筛选出真阳性差异条带[6,7]。经典的方法是将32个二次PCR产物分别标记探针,与比较标本的RNA做Northern blot杂交,排除假阳性条带后克隆;或者分别将32个差异条带的二次PCR产物克隆,再做Northern blot杂交鉴定。由于差异条带比较多,上述方法的工作量都比较大且繁琐,因此我们先采用反杂交(点杂交)法[8]对差异条带进行初步筛选,即将所有差示条带的二次PCR产物点尼龙膜,将绒癌总RNA逆转录后的cDNA标记探针与尼龙膜进行杂交,用高严格度条件洗膜,结果发现其中有11个阳性(34.4%)、21个阴性(65.6%);该方法国内尚未见报道。其中的阴性条带可能是由于PCR高度敏感,扩增出一些稀有mRNA片段,因而在杂交时由于量少而显示不出来,有一部分可能的确是非特异性扩增的假阳性带。
  我们对点杂交中阳性片段的二次PCR产物标记探针,与正常绒毛及绒癌的RNA进行Northern blot杂交确定阳性差异片段的基因大小,发现T26差异片段在绒癌中的表达远高于正常绒毛,相应基因约1.2kb大小,在其前方尚有一约4.4kb的条带,可能是由于mRNA前体的剪接不同所致.由目前结果可推测T26基因与绒癌的发生可能相关;但尚需对该片段克隆测序并进一步了解全长基因及其功能,以深入认识其与绒癌的关系。

本文图1~4见插图第16页

附:差异显示PCR引物具体序列

a:10×90μl Arbitrary primers(20μmol/L) b:9×90μl Oligo(dT) primers(20μmol/L)
 P1:5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3’
 P2:5’-ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3’
 P3:5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3’
 P4:5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3’
 P5:5’-ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3’
 P6:5’-ATTAACCCTCACT0AAATGCTGGGTG-3’
 P7:5’-ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3’
 P8:5’-ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3’
 P9:5’-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3’
 P10:5’-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3’ T1:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAA-3’
T2:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAC-3’
T3:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAG-3’
T4:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCA-3’
T5:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3’
T6:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCG-3’
T7:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3’
T8:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3’
T9:5’-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3

【基金项目】 卫生部科学研究基金资助项目(96-1-199)
【作者简介】 史桂芝(1973—),女(汉族),山东梁山人,博士,现在济南市妇幼保健院工作,邮政编码 250012
史桂芝(山东医科大学组织学胚胎学教研室,济南 250012)
高英茂(山东医科大学组织学胚胎学教研室,济南 250012)
顾晓松(南通医学院神经科学研究所,南通 226001)
刘梅(南通医学院神经科学研究所,南通 226001)
王宝恒(山东省高级人民法院技术室,济南 250014)

参考文献

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