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宫内感染乙型肝炎病毒儿童接种乙型肝炎疫苗免疫失败与其相关细胞因子关系研究
来源: 点击数: 更新时间:2012-7-23 文章录入:liuxing
    朱启镕于广军 吕晴 张公惠 顾新焕

  【摘要】 目的 从相关细胞因子探讨宫内感染乙型肝炎病毒(HBV)导致乙肝疫苗免疫失败的机制。方法 对HBV宫内感染免疫失败儿童13例(无反应组)、宫内感染免疫成功儿童13例(有反应组)和正常免疫儿童21例(正常组),测定血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)和分离外周血单个核细胞(PBMC)给予非特异性刺激植物血凝素(PHA)及特异性刺激乙型肝炎表面抗原(HBsAg),进行体外细胞培养,用流式细胞仪检测PBMC白细胞介素受体(mIL-2R,或称CD25),酶免夹心法检测PBMC受刺激后产生的IL-2、sIL-2R及IL-10的含量。结果 在PHA刺激下,三组对象PBMC表达mIL-2R的比例相近,差异无显著性,(F=0.107,P>0.05);而当HBsAg刺激下正常组与无反应组比较(t=12.21,P<0.001),有反应组与无反应组比较(t=7.43,P<0.001),差异有极显著性。三组对象PBMC的mIL-2受体表达水平无反应组最低,其次为有反应组,正常组最高,三组间差异有显著性。sIL-2R水平相比无反应组低于有反应组和正常组,差异有极显著性。无反应组IL-2产生低下,而IL-10只见有反应组在外来刺激后升高。结论 宫内感染HBV导致免疫失败者经PHA非特异性刺激及HBsAg特异性刺激,IL-2分泌能力低下;HBsAg特异性刺激IL-2膜受体表达不足。可能是宫内感染HBV导致乙肝疫苗免疫失败的机制之一。宫内感染HBV接种乙肝疫苗免疫成功者,IL-10分泌能力增高,显示与其能产生抗体有关。
  【关键词】 疾病传播,垂直  肝炎病毒,乙型  细胞活素类  肝炎,乙型

A study on the relationship between cytokines and failure of immunization with hepatitis B vaccine in children who had intrauterine HBV infection ZHU Qirong, YU Guangjun, LU Qing, et al. Children′s Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
  【Abstract】 Objective To study the immunoregulatory mechanisms of responsiveness and non-responsiveness to hepatitis B vaccine (HBVac) by analyzing the changes of IL-2/IL-2R system and IL-10 in children who had intrauterine hepatitis B virus (HBV) infection .Methods Forty-seven subjects, including 13 children who had intrauterine HBV infection and were not responsive to HBVac (non-responders), 13 children who had intrauterine HBV infection and were responsive to HBVac (responders) and 21 healthy children who were immunized against HBV (normal control).Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) taken from the subjects were cultured in vitro and PBMC mIL-2R was determined by using flow cytometry; IL-2, sIL-2R and IL-10 contents were determined by using “sandwich” enzyme immunoassay.Results After specific stimulation with HBsAg, the expression levels of mIL-2R of the 3 groups showed significant difference, the lowest level was seen in non-responder group and the highest in normal control group. The level of sIL-2R of the non-responder group was lower than those of responders and normal control group; this difference was statistically highly significant. The level of IL-2 production of the non-responder group was low. While only the responder group had increased production of IL-10 after exogenous stimulation.Conclusion Low level of IL-2 production and IL-2R expression after the HBsAg stimulation may contribute to immunization failure in children with intrauterine HBV infection ;there may be an immune tolerance mechanism. In responders who had intrauterine HBV infection, production of HBsAg-specific antibodies may be related to the elevated level of IL-10.
  【Key words】 Disease transmission, vertical  Hepatitis B virus  Cytokines  Hepatitis B

  我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发地区,母婴传播是HBV传播的主要途径之一,应用乙肝疫苗阻断HBV母婴传播是安全有效的,但仍有10%~20%的高危新生儿不产生抗-HBs,未能保护,呈免疫失败。研究证明宫内感染HBV是新生儿接种乙肝疫苗免疫失败的重要原因[1],国内外研究认为导致免疫失败的机制是胎儿期接触HBV抗原后对HBV的免疫耐受,T细胞耐受导致细胞免疫功能低下。研究表明白细胞介素-2(IL-2)及其受体系统在免疫调控网络中具有重要地位,可促进T细胞的成熟分化和B细胞的成熟增殖,白细胞介素-10(IL-10)是细胞免疫的有力抑制因子,但可促进B细胞的生长成熟和抗体的产生。本研究将从IL-2及其受体系统和IL-10的角度研究细胞因子调控网络与宫内感染HBV儿童接种乙肝疫苗免疫失败的关系。

材料和方法
  一、病例选择
  共检测自1996年1月~12月来我院乙肝疫苗随访门诊、符合入选条件的宫内感染HBV免疫失败儿童13例(无反应组),宫内感染HBV免疫成功儿童13例(有反应组),正常免疫儿童21例(正常组)。分组定义如下。
  1.宫内感染:由携带HBV母亲所生,凡出生时外周静脉血Abbott试剂检测HBsAg(+)和(或)HBeAg(+),或HBV-DNA(斑点杂交法)阳性,并持续至满月仍为阳性者。
  2.宫内感染免疫失败:指宫内感染小儿出生时接种乙型肝炎高效价免疫球蛋白(HBIG) 100 IU,1、2、7月龄时接种乙肝疫苗每次30 μg,而一年内HBsAg持续阳性,抗-HBs阴性者(无反应组)。
  3.宫内感染免疫成功:指宫内感染小儿出生时接种HBIG 100 IU,1、2、7月龄时接种乙肝疫苗每次30 μg,若一年内HBsAg转为阴性,抗-HBs阳性且滴度≥10 mIU/ml(有反应组)。
  4.正常免疫儿童:出生时及生后HBsAg或HBV-DNA持续阴性,接种HBIG及乙肝疫苗后抗-HBs阳性滴度≥10 mIU/ml(正常组)。
  二、随访方法
  出生时及出生后1、2、7月龄,1岁后每周岁为一个年龄期随访体检,询问精神、食欲、尿色,检查肝脏、脾脏及有无黄疸等。逢接种则于每期接种前采外周静脉血测HBV标志物、丙氨酸转氨酶(ALT)及细胞因子。
  三、实验方法
  1.血清中可溶性IL-2受体(sIL-2R)的测定为酶联免疫法,试剂盒由白求恩医科大学免疫教研室提供。
  2.外周血单个核细胞(PBMC)分离后分别以植物血凝素(PHA)及HBsAg作为刺激物,留取细胞测白细胞介素膜受体(mIL-2R),离心培养细胞悬液,取上清液(-40℃保存),测IL-2、IL-10、sIL-2R。
  3.白细胞介素-2膜受体[mIL-2R(CD25)]用流式细胞仪(FACS)检测,CD25单抗由美国Bection Dickinson公司提供。上机检测计算5 000个细胞中有荧光标记细胞的百分比。IL-2酶联免疫测定试剂由美国Biosourse公司提供。IL-10双抗体夹心ELISA法,试剂由Pharmingin公司提供。细胞培养液上清液中sIL-2R,测定方法同血清sIL-2R。
  4.除mIL-2R外,标本均储存于-40℃,同期同样实验条件下,分别采用酶联免疫法于酶标计按要求在450或490 nm下读取吸光度A(曾称光密度OD)值,计算样品含量。
  四、统计分析
  SPSS软件进行统计学处理。正态分布,方差齐性的计量资料:多组比较采用方差分析(F);两组比较采用t检验。正态分布,方差不齐的计量资料:两组比较采用校正t检验(t′)。计数资料用卡方分析。相关分析:用等级相关分析。

结 果
  一、检测对象的情况和血清sIL-2R水平与ALT相关性分析
  共检测47例,其中宫内感染无反应组13例,有反应组13例,正常免疫组21例,三组的年龄、性别间差异无显著性(P>0.05);无反应组ALT最高,但由于个体差异大,经秩和检验与有反应组差异未达显著价值,而高于正常值(t=2.19, P<0.05);有反应组sIL-2R较低,但三组间差异亦无显著性。三组中的无反应组ALT与sIL-2R呈正相关(rs=0.67,P<0.05),见表1。

    表1 三组患儿血清sIL-2R水平与ALT的相关分析


组 别 例数 年龄
(月) ALT与sIL-2R
相关:rs
男 女 合计 ALT(IU/L) sIL-2R(kU/L)
正常组 15
6
21
50±6
9.6±0.8*
344±41
0.33

有反应组 9 4 13 63±7 10.5±2.3 257±35 0.08
无反应组 8 5 13 58±7 30.9±12.4 345±58 0.67*
组间比较 χ2=0.37 F=1.05 F=1.12  

*无反应组存在等级相关系,P<0.05

  二、PBMC mIL-2R即CD25的表达
  在PHA刺激下,三组对象PBMC表达mIL-2R的比例相近,差异无显著性,(F=0.107,P>0.05),而当HBsAg刺激下正常组与无反应组比较(t=12.21,P<0.001),有反应组与无反应组比较(t=7.43,P<0.001),差异有极显著性。见表2。

    表2 三组PBMC分别经PHA、HBsAg刺激后mIL-2R
表达结果及比较()


组 别 例数 mIL-2R阳性细胞比例(%)
PHA刺激 HBsAg刺激
正常组  14 23.3±3.1 9.4±1.5
有反应组 13 23.3±4.4 5.7±1.0
无反应组  9 24.4±4.4 2.6±0.9


  三、细胞培养上清液中sIL-2R、IL-2及IL-10表达水平的比较
  在PHA刺激下sIL-2R三组比较存在差异,但正常组与无反应组之比(t=1.60,P>0.05),有反应组与无反应组之比(t=2.02,P>0.05),而HBsAg刺激下无反应组明显低于有反应组和正常组,正常组与无反应组之比(t=13.40,P<0.001), 有反应组与无反应组之比(t=16.86, P<0.001),差异有显著性。
  细胞培养上清液中IL-2含量经PHA刺激发现无反应组明显低于有反应组和正常组,正常组与无反应组之比(t=8.84,P<0.001),有反应组与无反应组之比(t=11.37,P<0.001),差异有显著性;HBsAg刺激结果正常组与无反应组之比(t′=13.48, P<0.001),有反应组与无反应组之比(t′=12.42, P<0.001),与PHA刺激的结果类似。
  细胞培养上清液中IL-10的测定经PHA刺激后发现有反应组IL-10含量明显高于无反应组和正常组,正常组与无反应组之比(t=0.75,P>0.05),有反应组与无反应组之比(t=9.85,P<0.001),差异有显著性;经HBsAg刺激同样发现,正常组与无反应组之比(t=1.00,P>0.05),而有反应组与无反应组之比(t=9.85,P<0.001),正常组与有反应组之比(t=7.15,P<0.001),差异有显著性,见表3。

    表3 三组在PHA、HBsAg刺激下细胞培养上清液中sIL-2R、
IL-2、IL-10表达水平及比较


组别 sIL-2R(kU/L) IL-2(ng/L) IL-10(ng/L)
例数 PHA刺激 HBsAg刺激 例数 PHA刺激 HBsAg刺激 例数 PHA刺激 HBsAg刺激
正常组 17 100±28 14.1±2.0
15 142±29 122±25 14 332±96 29±18
有反应组 13 159±38 13.4±1.1 12 157±27 141±30 12 878±154 59±32
无反应组 11 123±46 4.8±1.4 9 53±5 33±4 8 303±68 21±21


讨 论
  国内外的一些研究认为胎儿期接触HBV的抗原造成对HBV的免疫耐受是导致免疫失败的重要机制,而这种免疫耐受是不完全的,部分可逆转[1]。进一步发现宫内HBV感染儿童中有一部分免疫成功,即可以对乙肝疫苗发生反应产生抗体[2]。宫内HBV感染接种乙肝疫苗免疫失败小儿的非特异性淋巴细胞增殖反应(PHA刺激)和特异性淋巴细胞增殖反应(HBsAg刺激)均低于宫内感染接种乙肝疫苗有反应儿童和正常免疫儿童,而且免疫失败儿童的外周血T细胞亚群比例失调,即CD4+细胞降低,CD8+细胞升高[3]。本研究从细胞因子网络作深入探讨,结果显示宫内感染无反应组与宫内感染有反应组以及正常组相比,ALT虽在正常至可疑损害之间(25~40 IU/L),但三组均值存在差异,尤其无反应组明显高于正常组。血清sIL-2R水平无明显差异,而对宫内感染无反应组的血清sIL-2R与ALT值之间存在等级相关关系,说明血清sIL-2R在一定程度上反映了肝细胞的损坏程度。mIL-2R是活化的T淋巴细胞的标志物,mIL-2R与IL-2的结合使淋巴细胞活化,淋巴细胞能否表达足够量的mIL-2R是机体能否发挥正常细胞免疫功能的重要因素[4]。结果显示在PHA刺激下宫内感染无反应组、有反应组、正常组三者的PBMC的mIL-2R表达水平无差异,而在HBsAg刺激下,无反应组的mIL-2R表达水平明显低于有反应组,而有反应组又低于正常组,提示宫内感染无反应组对HBsAg刺激的免疫无应答与IL-2受体的表达不足有关,造成淋巴细胞活化障碍,不能有效地产生抗体,也提示此类患儿对HBsAg的免疫耐受有关。细胞培养上清液的sIL-2R在PHA刺激下三组虽亦有差异,但无显著性,而HBsAg刺激无反应组明显低于有反应组,与mIL-2R的结果类似,这是因为细胞培养上清液的sIL-2R主要来源于PBMC的mIL-2R,由于此方法简便和便宜,可作为反映mIL-2R水平的简便指标,这与血清sIL-2R不同,后者不仅来自PBMC,也可来自肝脏及其他脏器的淋巴细胞[5]。
  IL-2主要由TH1细胞分泌的细胞因子,具有广泛的免疫调节功能,尤其可增强NK细胞、巨噬细胞的细胞毒性作用,诱导其它细胞因子(如IFNγ和TNFα等)的产生,促进B细胞的增殖、分泌和合成抗体。对HBV的免疫作用也有赖于正常IL-2产生和IL-2R的表达[6]。结果表明,无反应者同时IL-2产生能力低下,提示宫内HBV感染患儿乙肝疫苗接种无效也与此有关。
  IL-10主要是Th2细胞分泌的一种细胞因子(CKS)又称细胞因子合成的抑制因子(CSIF),在细胞和体液免疫的平衡与稳定的调控中起重要作用,是细胞免疫的有力抑制因素,抑制TH1类细胞因子(IFNγ、TNFα、IL-2)的分泌,还具有免疫促进作用,促进B细胞抗体的产生[7,8]。研究表明只有在宫内感染有反应组才见IL-10水平的升高,提示可能与IL-10促进B细胞增殖成熟产生抗体有关。根据体液免疫与细胞免疫的交互作用原理,利用IL-10对体液免疫反应的增强作用和对细胞免疫的抑制作用,也许可用来控制疫苗接种的免疫反应类型而获得更好的保护效应[9]。
  本课题由国家自然科学基金资助(基金编号:39670667)
  作者单位:200032 上海医科大学儿科医院

参考文献
 1 于广军,朱启镕.乙型肝炎病毒母婴传播及其免疫学预防的研究进展.国外医学流行病学传染病学分册, 1996, 23: 40-42.
 2 朱启镕,段恕诚,徐华芳,等.乙型肝炎病毒宫内感染儿童的三年随访.中华儿科杂志, 1993, 31: 8-9.
 3 朱启镕,吕晴,俞蕙,等.宫内感染HBV婴儿接种乙肝疫苗免疫失败的机理及预后研究.中华儿科杂志, 1997, 35: 349-352.
 4 Waldmann TA. The IL-2/IL-2R receptor system: a target for retional immune intervention. Immunol Today ,1993,14: 264.
 5 Rubin LA, Nelson DL. The soluble interleukin-2 recepter: biology function and clinical application. Ann Intern Med, 1990, 113: 619-627.
 6 唐建武.白细胞介素-2及其受体与肿瘤基因治疗.国外医学微生物学分册, 1995, 17: 12-16.
 7 Rivas JM, Ullrich SE. Kerainoyte-derived IL-10. J Invest Dermatol, 1992, 98: 578-581.
 8 Yssel HD, Waal MR, Roncarolo MG, et al. Interleukin 10 is produced by subsets of human CD4+ T cell clones and peripheral blood T cells. J Immunol, 1992, 149: 2378-2384.
 9 Mosmann TR, Moore KW. The role of IL-10 in crossregulation of TH1 and Th2 responses. Immunol Today ,1991, 12: A44-A53.


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