张寿斌1 ,廖华1 ,黄呈辉2 ,谭庆瑜1 ,张炜灵1 ,黄艳1 ,陈侃1 ,邱素清1 ,林静1 ,幸思忠3 ,廖月红1
(1. 深圳市第八人民医院海富社康中心,广东深圳　518101; 2. 深圳市宝安区血站分子生物研究室,
广东深圳　518101; 3. 深圳市宝安区卫生局,广东深圳　518101)
　　[摘　要]目的 了解该地区手足口病临床和流行病学特征,明确其肠道病毒血清型分布。
             方法　分别在肠道病毒基因组5′端非编码区, CAV16和EV71 VP1区设计通用引物和特异性引物,建立RT2nPCR检测  方法,对手足口病病人进行肠道病毒基因检测,鉴别其血清型,根据血清型不同比较其临床特征。结果　237例手足口病均有口腔黏膜疹和手足皮疹,发热141例(59. 5% ) ,低热为主, 6岁以下占94. 5% ,以春夏季节为多(67. 9% ) 。肠道病毒通用引物RT2nPCR检测阳性133例(56. 1% ) ,其中EV71 38例, CAV16 64例,二者均阴性31例。12株肠道病毒PCR阳性产物基因克隆、测序,证实分别为EV71 5株、CAV16 5株、ECHO13 1株、CAV5 1株。结论　手足口病病
原体以EV71和CAV16为主,另有CAV5, ECHO13,临床症状与肠道病毒血清型关系不大。
    [中国当代儿科杂志, 2008, 10 (1) : 38 - 41 ]
   [关　键　词] 　手足口病;肠道病毒;血清型;临床特征;儿童
[中图分类号] 　R373. 2　　[文献标识码] 　A　　[文章编号] 　1008 - 8830 (2008) 01 - 0038 - 04
Serum types of en terov irus and clin ica l character istics of 237 ch ildren with hand ,
foot and mouth d isea se in Shenzhen
ZHANG Shou2B in, L IAO Hua, HUANG Cheng2Hui, TAN Q ing2Yu, ZHANGW ei2L ing, HUANG Yan, CHEN Kan, Q IU Su2
Q ing, X ING S i2Zhong, L IAO Yue2Hong. Haifu Comm unity Health Service Center, Eighth People′s Hospital of Shenzhen,
Shenzhen, Guangdong 518101, China ( Em ail: bahfsk@126. com )
　　Abstract: Objective　To study the clinical and ep idemiologic characteristics and the serum types of enterovirus of hand, foot and mouth disease (HFMD) in children. Methods　The RT2nPCR method was established with universal p rimerswithin 5′untranslated region of enterovirus and VP1 region of Coxsackievirus A16 (CAV16) and enterovirus 71( EV 71 ). Enteroviruses were detected with RT2nPCR in 237 children with HFMD. Clinical and ep idemiologic   characteristics and serum types of enterovirus of the patients with HFMD were studied. Results　The patients′age ranged  from 7 months to 11 years (mean 4. 2 ±0. 5 years). The majority (94. 5% ) were less than 6 years old. HFMD wasmostly seen in sp ring and winter (67. 9% ). Oralmucosal pox or ulcer as well as hand and foot rashes were observed in all 237  patients. Fever occurred in 141 patients (59. 5% ). Of the 237 patients, 133 (56. 1% ) were RT2nPCR positive. Of the  133 cases, 38 were positive for EV71, 64 were positive for CAV16, and 31 were negative for both EV71 and CAV16. The patients infected by different types of enteroviruses had similar clinical characteristics. Gene colon and sequence analysis for 12 strains of enteroviruses PCR positive p roducts p resented as EV71 ( n = 5) , CAV16 ( n = 5) , ECHO13 ( n = 1) , and
CAV5 ( n = 1). Conclusion s　HFMD tends to occur in younger children less than 6 years old. The majority are affected in spring and winter. EV71 and CAV16 are common pathogens of HFMD. There is no relationship between clinical  characteristics and serum types of enteroviruses in HFMD patients. [ Ch in J Con temp Ped ia tr, 2008, 10 ( 1) :38 - 41]
　　Key words: 　Hand, foot and mouth disease; Enterovirus; Serum type; Clinical characteristics; Child

　  自1959年由人类肠道病毒( enterovirus, EV)导致手足口病( hand, foot and mouth disease, HFMD)报道以来, HFMD已经在全球多次暴发。早期HFMD主要由肠道病毒柯萨奇A16 (Coxsackie A16, CAV16)引起, 1974年美国发现肠道病毒71型(EV71)也常致HFMD流行,此外柯萨奇A9 (CAV9)、柯萨奇A5(CAV5)致HFMD 也有报道。导致1997 ～1998 年东南亚和我国台湾省、香港地区大规模手足口病流行的主要是EV71。由于HFMD常常由多种EV共同引起,而EV71和CAV16往往是手足口病暴发流行的最主要病原,二者在遗传学上密切相关。通常情况下, EV71与CAV16引起的HFMD在临床症状上难以区别,但EV71感染除了引起HFMD以外,还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹,易致严重的神经系统疾病,甚至危及生命,因而具有更大的危害性。本文采用EV 5′端非编码区通用引物和EV71、CAV16 VP1 区特异性引物对237例手足口病病人进行RT2PCR肠道病毒RNA检测,以了解手足口病病原及流行特征。
     1　研究对象与方法
     1. 1　研究对象
     237例为我院2001～2004年住院和门诊临床诊断手足口病病人,手足口病诊断标准: ①有或无发热;②口腔黏膜疹,可形成溃疡; ③皮疹,部分有水泡,以手掌、足底为多; ④伴或不伴中枢神经系统症状。
     1. 2　标本采集与储存
     用无菌方法采集急性期病人(病后3～7 d内)的粪便1～2 g,置于灭菌的带盖玻璃瓶中。同时用干棉签准确地擦拭患儿的鼻咽部后,立即浸泡于含2～3 mL Hanks液的灭菌试管,必要时留取脑脊液2～3 mL,以上标本均立即- 70℃冻存。
     1. 3　引物的设计
     根据GenBank中收录的常见EV 5′端非编码区(UTR)保守的基因序列,采用OL IGO5. 0软件辅助设计两对肠道病毒5′UTR通用引物,引物序列分别为: EVP160: 5′-CAA GCA CTT/A TTC /A CCC CGG-3′; EVP250:5′-TAC TTC GAG/A CCT AGT A -3′;EVP500: 5′-ACA CCC AAA GTA GTC GGT TCC GC-3′;EVP580: 5′-ATT GTA CCA TAA GCA GCC A23′。其中EVP160、EVP580 为外引物, EVP250、EVP500为内引物,可以产生312 bp大小的扩增产物。EV71特异性引物序列为: EV7121: 5′2 ACY ATG AAA YTG  TGY AAG GA23′, EV7122: 5′2 CCR GTA GGK GTR CAC GCA AC23′, Y =C /T, R = G/A, K = G/T; EV712 3: 5′2 CAG GGR GAY AGR GTG GCA GAT G23′,EV7124: 5′2 TCA ATC ATA CTC TCR TCA CTA G23′,其中Y = T/C, R =A /G;其中EV7121, EV7122 为外引物, EV7123, EV7124为内引物,可以产生434bp大
小的扩增产物。CA16 特异性引物序列为:CA16P1S: 5′2 ATT GCA GAC ATG ATT GAC CAG -3′, CA16P2S: 5′2 TGT GTG TTG AAC CAT CAC TC CAC23′, CA16P476: 5′2 GGK GGP ACA ACA TGT
ACT GC23′,其中P = C /G, K =A /C, R =A /G,可以产生230 bp 大小的扩增产物。引物由上海生工生
物工程公司合成。
       1. 4　标本总RNA提取采用TR IZOL2LS Reagent提取总EV RNA。
       1. 5　RT2n2PCR扩增和检测
       逆转录合成cDNA 反应: 取5 ×AMV 缓冲液3. 0μL, 20 mMol/L dNTPs 0. 15 μL,随机六聚体引物1. 0 μL,加去离子水0. 85 μL, AMV 逆转录酶,RNA模板10 μL, cDNA反应液总体积为15μL,反应参数: 42℃, 45 min,然后72℃, 10 min。第1 轮PCR 反应条件: 取cDNA 模板5 μL, EVP160、EVP580引物各0. 15μL,其余条件参考文献[ 8 ] 。第2轮PCR反应条件:取第1轮PCR产物3μL作模板,用50 μmol/L EVP250 引物、EVP500 引物各0. 15μL进行第2次扩增,其余扩增条件同第1轮。特异性EV71和CAV16扩增条件同,但CAV16半巢式扩增第2次引物为CAV16P476和CAV16P2S。取第2轮PCR产物10μL用2%琼脂糖凝胶电泳, EB
染色(含EB 0. 5μg/mL) , 100 V电泳30 min,紫外灯下观察,在相应位置可见清晰条带为阳性。
       1. 6　PCR产物的克隆
      将PCR产物经产物回收试剂盒进行回收,使用T2Vector试剂盒,将片段与pGEM2T easy载体质粒进行连接反应, 4℃过夜,转化感受态DH5,蓝白筛选,挑取白色菌落进行鉴定,确定阳性克隆(pGEM-EV- 5′UTR、pGEM-EV71-VP1、pGEM-CAV16-VP1) 。PCR产物经低熔点胶回收纯化后, 连接到pBlu2
scrip t2T载体上,转化感受态菌XL12B lue,经蓝白斑筛选, PCR及酶切鉴定阳性克隆后,对阳性菌落接种培养,提取质粒。
      1. 7　核苷酸序列测定及分析
     将阳性克隆送北京赛百胜生物有限公司进行测序,测序采用AB I377 型自动测序仪进行。所得基因序列输入www. ncbi. nlm. nih. gov,通过BLAST软件程序与最近发表的EV 5′UTR、EV71-VP1、CAV16-VP1独特区相关序列比较,并向国际GenBank提交
核酸序列并注册。
       2　结果
       2. 1　手足口病年龄与性别分布
      237例手足口病患儿年龄范围7月至11岁,平均年龄4. 2 ±0. 5岁,其中0～11月45例(19. 0%) ,1～3 岁76例( 32. 0% ) , 4～6岁103例( 43. 5%) ,7～11岁13例( 5. 5% ) , 6岁以下占94. 5%;男132例,女105例,男女比例1. 26。其中有153人次来源于托幼机构(64. 6% ) , 23人次系同胞关系。
      2. 2　手足口病发病与季节、年度关系
   手足口病全年都有发病,多呈局部小暴发流行,112例有明显接触史,占47. 3%;散发87例为散发,占36. 7%。发病季节3～5月64例(27. 0% ) , 6～8月97例(40. 9%) , 9～11月32例(13. 5% ) , 12～2月44例( 18. 6% ) ; 2001年67例, 2002年119例,2003年23例, 2004年30例;以春夏季节为多。
      2. 3　手足口病临床特征
    237例手足口病,发热141 例( 59. 5% ) ,热程1～7 d,发热多发生在出疹之前1～2 d,年龄越小越呈高热趋势。237例均有口腔黏膜疹,粟粒至绿豆大小,初为深红色,破溃形成小溃疡,周围有红晕,疼痛明显致使进食困难及流涎,约5～10 d愈合。皮疹见于所有病例,分布于手、足部,以手掌、足底两侧和足跖为多,为玫瑰红色充血性斑丘疹或疱疹,呈圆形或椭圆形,丘疹直径1 ～2 mm,疱疹直径在2 ～4 mm,呈灰白色,周围绕以红晕;臀部皮疹112 例,部分小儿皮疹先由双侧臀部开始,另有膝部皮疹54例,躯干部皮疹21例。流涎152例( 64. 1% ) ,拒食122例(51. 5% ) ,部分出现流涕,咳嗽,腹泻,皮肤瘙痒。并发症:病毒性心肌炎7例,病毒性脑膜脑炎2例,肺炎3例。
       2. 4　RT2PCR检测手足口病肠道病毒血清型比较及基因序列分析
    237例手足口病均进行肠道病毒通用引物RT-nPCR检测,其中阳性133例,阳性率56. 1%。为进一步明确手足口病肠道病毒血清型, 133例肠道病毒通用引物阳性病例均进行EV71特异性引物RT-PCR (巢式)和CAV16 特异性引物RT-PCR (半巢式)检测,结果EV71 阳性38 例( 28. 6% ) , CAV16阳性64 例( 48. 1%) ,无交*阳性,二者均阴性31例(23. 3% ) 。12株肠道病毒PCR阳性产物(5株5′UTR, 3株EV71VP1, 4株CAV16VP1)经基因克隆纯化后自动基因测序,基因序列(另文发表)已提交至国际核酸与蛋白GenBank数据库。证实5株EV 5′UTR基因序列片段分别为EV71 2株、CAV16 1株、ECHO13 1 株、CAV5 1 株, 其中EV71、CAV16 与VP1特异性引物检测结果相符合,而3株EV71VP1序列片段, 4株CAV16 VP1序列片段,均证实分别为EV71和CAV16,具体如表1所示。

表1　12株国际GenBank注册肠道病毒血清型与RT2PCR检测结果比较
               RT2PCR 检  测  结   果
编号 性别 5′UTR特异  EV71特异 CAV16特异     PCR阳性   国际GenBank  注册号  肠道病毒  血清型
          引物（巢式）引物（巢式）引物半巢式 产物的位置
1 男 +  +  -  5′UTR  AY935539   EV71
2 女 +  -  -  5′UTR  AY935540   CAV5
3 男 +  -  +  5′UTR  AY935541   CAV16
4 女 +  -  -  5′UTR  AY935542   ECHO13
5 男 +  -  +  5′UTR  AY935543   EV71
6 女 +  +  -  VP1     AY899277   EV71
7 男 +  +  -  VP1     AY899278   EV71
8 男 +  +  -  VP1      AY899279  EV71
9 男 +  -  +  VP1     AY775308   CAV16
10女 +  -  +  VP1      AY775309  CAV16
11女 +  -  +   VP1     AY775310  CAV16
12男 +  -  +  VP1      AY775311  CAV16

       2. 5　EV71、CAV16所致手足口病临床特征比较
      通用引物PCR 检测阳性者133 例, 其中经EV71 VP1特异性PCR检测阳性38例, CAV16阳性64例,二者均阴性31 例,三者临床表现之间无差别,结果见表2。

表2　EV71、CAV16所致手足口病临床特征比较
EV种类 例数 年龄 发热程度( ℃) 发热持续时间( d) 白细胞数( ×109 /L)    皮疹愈合时间( d)口腔黏膜疹例数  手足皮疹例数并发症例数  死亡  例数
EV71            38  4. 2 ±0. 4  37. 6 ±0. 5  2. 2 ±0. 6  5. 6 ±0. 6  7. 1 ±1. 6  38  38   3   0
CAV16        64  4. 2 ±0. 3  37. 7 ±0. 3  2. 1 ±0. 7  6. 6 ±0. 7  6. 6 ±0. 9  64  64    3   0
非EV71非CAV16 31  4. 3 ±0. 4  37. 6 ±0. 4  2. 1 ±0. 4  6. 2 ±0. 4  7. 2 ±1. 1 31 31 2  0

          3　讨论
       手足口病是全球性传染病,最早于1957年由新西兰Seddon加以描述, 1958年加拿大Robinson[ 1 ]从
HFMD患者中分离出CAV16,以后数年内的报告几乎都是由该病毒所致。自1974年美国学者从一脑炎病人的标本中分离出EV71肠道病毒后,手足口病与EV71感染的关系得到广泛的重视。此后, EV71感染与CAV16感染交替出现,成为手足口病的主要病原体。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行[ 2 ] ,仅4～6月就有29例病人死亡。1998年[ 3 ] EV71感染在我国台湾省引发大量手足口病和疱疹性咽峡炎,在6月和10月两波流行中,共监测到129 106 例病例,重症病人405 例,死亡78例,大多为5岁以下的儿童,并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎,分离出病毒的病人中, EV71分离率为48. 7% ,同时发现有相当数量病人为CAV16感染。目前世界上几起严重的手足口病暴发流行均由EV71 引起, 而CAV16则极少导致手足口病的大规模暴发流行。我国于1980年由上海首先报道本病[ 4 ] ,以后各地均有报道。病毒分离和血清学实验研究表明, 1985年以前CAV16是该病的唯一病原,最近的研究结果显示尽管病原仍然以CAV16为主,但EV71在手足口病的病原学中占有越来越重要的地位。1989年湖北医学院病毒所[ 4 ]从成人手足口病患者分离出EV71,1998～1999年深圳市卫生防疫站[ 5 ]从手足口病患者疱疹液中检出EV71,此后,在我国上海[ 6 ] 、广州、福建[ 7 ]均分离出EV71。广州、深圳、武汉和上海地区的EV71流行株在核苷酸组成上有很大相似性,结合遗传进化分析结果推断,我国大陆地区流行的EV71株在进化上属于同一组,我国手足口病流行,其病原主要为CAV16和EV71型。本研究中237 例手足口病病人检出肠道病毒133 例( 56. 1% ) , 其中EV71 特异性检测38 例(28. 6% ) , CAV16特异性检测64例( 48. 1% ) ,且无交*阳性。12例克隆基因序列片段经国际GenBank证实10例血清型与特异性PCR检测结果相符合,另有2例为CAV5和ECHO13,提示特异性引物检测异性高,本地区HFMD仍然以EV71, CAV16为主,同时CAV5和ECHO13感染也是可能原因之一。2000年,国内李秀珠等[ 6 ]在对手足口病的研究中也曾发现一株ECHO13。通常情况下, EV71 与CAV16 引起的手足口病在临床症状等方面难以区别,但EV71易致无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关性疾病,可危及生命;流行病学研究表明二者常常伴随流行引起手足口病暴发。CAV16往往是主要的病原,常常超过感染总人数的60%。EV71感染主要为CAV16和EV71型。本研究中237 例手足口病病人检出肠道病毒133 例( 56. 1% ) , 其中EV71 特异性检测38 例(28. 6% ) , CAV16特异性检测64例( 48. 1% ) ,且无交*阳性。12例克隆基因序列片段经国际GenBank证实10例血清型与特异性PCR检测结果相符合,另有2例为CAV5和ECHO13,提示特异性引物检测特异性高,本地区HFMD仍然以EV71, CAV16为主,同时CAV5和ECHO13感染也是可能原因之一。2000年,国内李秀珠等[ 6 ]在对手足口病的研究中也曾发现一株ECHO13。通常情况下, EV71 与CAV16 引起的手足口病在临床症状等方面难以区别,但EV71易致无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关性疾病,可危及生命;流行病学研究表明二者常常伴随流行引起手足口病暴发。CAV16往往是主要的病原,常常超过感染总人数的60%。EV71感染的临床症状在不同地区、不同时间表现不尽相同,有的表现手足口病为主,中枢神经系统症状较少,有的则相反[ 8, 9 ] 。尽管大量国内外研究认为, EV71, CAV16 所致HFMD临床表现大致相同, EV71更多伴发中枢神经系统症状,但本研究EV71, CAV16所致手足口病临床表现在发病年龄,发热程度,发热持续时间,皮疹,以及合并症方面均无明显差别,而且临床症状普遍较轻微,经过良好。Ho等报道[ 3 ] , EV感染有明显的季节性,夏秋季节感染率较高,但本研究病例以春夏季为多,全年均发,冬季比例并不低,可能与本地区冬春气温较高有关。

[参　考　文　献]
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[ 3 ] 　HoM, Chen ER, Hsu KH, Twu SJ, Chen KT, Tsai SF, et al. Anep idemic of enterovirus 71 infection in Taiwan [ J ]. N Engl JMed,1999, 341 (13) : 9292935.
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